在氨基酸组分测定中,紫外检测器的最佳检测波长范围需根据氨基酸类型及检测方法综合确定,核心结论为:芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)的最佳检测波长为280nm;衍生化氨基酸的检测波长需根据衍生试剂特性选择,常见范围为220-248nm;非衍生化氨基酸的直接检测波长通常低于220nm,但灵敏度较低。以下为具体分析:
色氨酸:具有最强的紫外吸收能力,其最大吸收峰波长为280nm。在氨基酸组分测定中,若目标氨基酸包含色氨酸,280nm是最佳检测波长。
酪氨酸:其最大吸收波长为275nm,但通常与色氨酸一起,在280nm波长下进行检测,因为该波长下两者的吸收均较为显著。
苯丙氨酸:虽然其最大吸收波长略低于280nm,但在280nm波长下仍有一定的吸收,因此也可与色氨酸、酪氨酸一起在该波长下进行检测。
衍生化目的:由于大部分氨基酸在220nm波长以下才有紫外光吸收,且紫外吸收较弱,同时氨基酸极性偏大,用反相方法分析时保留能力差,不易于分离。因此,一般的检测方法在检测氨基酸时需要进行柱前或柱后的衍生,使氨基酸易于分离且有较好的紫外吸收。
常见衍生试剂:如异硫氰酸荧光素(FITC)、邻苯二甲醛(OPA)等。这些衍生试剂与氨基酸反应后,生成的衍生物具有特定的紫外吸收波长。
检测波长选择:
FITC衍生:衍生物的激发波长为490nm,发射波长为515nm。但通常使用紫外检测器时,关注的是其吸收波长,而非发射波长。不过,这一信息说明了FITC衍生后氨基酸的检测波长会发生变化。
OPA衍生:除胱氨酸和半胱氨酸外,OPA能在2-巯基乙醇或3-巯基丙酸存在的条件下,与一级氨基酸反应生成荧光化合物,其激发波长为340nm,发射波长为455nm。同样地,使用紫外检测器时,应关注其吸收特性。实际上,OPA衍生后的氨基酸通常在246-248nm波长范围内有最大吸收。
其他衍生试剂:如AQC等,与氨基酸反应后的衍生产物也具有特定的紫外吸收波长。有研究表明,20种氨基酸与AQC反应后的衍生产物在226-248nm波长范围内有最大吸收,其中多数氨基酸在247nm或248nm波长时有最大吸收。
直接检测限制:非衍生化的氨基酸在紫外区的吸收较弱,且大多数氨基酸在220nm波长以下才有显著的紫外吸收。因此,直接使用紫外检测器检测非衍生化氨基酸的灵敏度较低。
检测波长选择:若需直接检测非衍生化氨基酸,通常需选择低于220nm的波长。但需注意,波长越短,基线噪音越大,可能影响检测的准确性和稳定性。有研究考察了多个波长下的检测效果,发现210nm处具有较高的灵敏度和稳定性,因此可选用该波长作为检测波长。然而,这一选择并非绝对,具体波长还需根据实验条件和仪器性能进行优化。